《自然》:打造转移的“引擎” 癌细胞居然会这样!

肿瘤转移是癌症死亡的重要原因。

肿瘤转移是一个多步骤的过程,充满了饥饿、缺氧等对肿瘤生存不利的磨难。为了在这个过程中生存,肿瘤细胞需要足够的代谢可调性。

线粒体是细胞能量代谢的核心细胞器,能使细胞更好地适应周围环境,因此也是肿瘤细胞转移的核心调节因子[1]。然而,目前还不太清楚肿瘤细胞如何快速调节线粒体的代谢模式以帮助其转移。

在线粒体有氧呼吸链中的蛋白质复合物中,至少有13种是由线粒体DNA编码并在线粒体中合成的。这些复合物的翻译效率将明显影响线粒体的功能状态。现有研究表明,与细胞质基质中的蛋白质翻译系统不同,线粒体仅使用一个tRNA——tRNAMetCAU——来识别AUA和AUA两个密码子。为了做到这一点,tRNAMet需要在第34个胞嘧啶上进行5-甲酰胞嘧啶(f5C34)修饰。

tRNAMet上f5C34修饰的形成通常需要两步,首先NSUN3催化m5C的形成,然后ALKBH1将m5C转化为f5C[2,3]。在人类中,NSUN3功能的丧失与线粒体呼吸链的缺陷有关,但尚不清楚线粒体中tRNA的f5C修饰是否会影响线粒体的功能,进而影响肿瘤细胞的转移能力。

近日,德国癌症研究中心米凯拉弗莱教授领导的研究团队在著名学术期刊《自然》上发表了重要研究成果[4]。他们发现,由NSUN3和ALKBH1介导的m5C34和f5C34对肿瘤转移非常重要。NSUN3缺陷虽然不会影响原发肿瘤的生长,但会使肿瘤失去转移能力。

从机理上讲,线粒体中tRNAMet的m5C34和f5C34修饰对线粒体中的蛋白质合成非常重要。m5C34和f5C34修饰缺失导致线粒体呼吸链复合体合成效率显著下降,进而导致肿瘤细胞代谢可塑性下降,有氧呼吸能力下降,无法为转移性肿瘤细胞提供足够的能量。

更重要的是,本研究表明抑制线粒体中mRNA的翻译可以有效抑制肿瘤转移,为后续开发新的肿瘤治疗方法提供了参考。

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为了研究线粒体中tRNA的f5C修饰对肿瘤细胞的影响,研究团队首先进行了fCAB测序(化学辅助亚硫酸氢盐测序)和RNA-seq,检测线粒体中tRNA的m5C和f5C修饰的丰度和分布。

通过分析测序结果,他们发现线粒体中的tRNAMet是正常细胞或癌细胞中唯一带有f5C修饰的tRNA。tRNAMet中最常见的修饰是m5C(约50%的C被修饰),其次是f5C(约35%),未修饰的C仅占10%左右。

然而,在用shRNA靶向NSUN3的细胞中敲除NSUN3后,tRNAMet中的m5C和f5C修饰显著减少,f5C34修饰几乎消失。

由于tRNAMet对于翻译的起始和延伸非常重要,研究小组想知道tRNAMet中的m5C和f5C修饰缺陷是否会影响线粒体中的蛋白质合成。因此,他们检查了去除NSUN3后线粒体中新生蛋白的比例,发现NSUN3的缺失显著降低了新生蛋白的比例,表明tRNAMet中的m5C和f5C缺陷会降低线粒体中蛋白质的合成效率。

众所周知,线粒体编码许多与有氧呼吸相关的蛋白质,那么tRNAMet中m5C和f5C修饰缺陷导致的蛋白质合成效率降低会影响线粒体呼吸功能吗?

为了找出这个问题,研究小组检测了线粒体中TCA代谢物的浓度,发现NSUN3缺乏后各种TCA代谢物的浓度下降。为了验证m5C是否直接调节线粒体的活性,研究小组在肿瘤细胞中过表达WT或NSUN3,并比较这些细胞的线粒体呼吸能力。发现过度表达NSUN3且酶活性缺失突变的细胞线粒体中TCA代谢物浓度降低,有氧呼吸能力下降,糖酵解增加。同时,NSUN3缺失的线粒体更圆,嵴数量明显减少。这些数据表明,线粒体tRNAMet中的m5C和f5C RNA修饰可以反映细胞的能量需求,并相应地调整线粒体的功能。

因为线粒体参与肿瘤发生的大多数方面。为了研究肿瘤发生的哪些阶段涉及线粒体m5C和f5C修饰,研究小组在小鼠中构建了原位移植肿瘤模型。

他们在小鼠口腔中原位植入了三种NSUN3缺陷的转移性口腔鳞状细胞癌细胞系:SCC25、VDH01和VDH15。此外,他们在肿瘤细胞中过量表达WT或NSUN3蛋白,并将其原位植入小鼠口腔。

 

实验结果表明,所有肿瘤细胞均能在小鼠接种原位生长,产生原位瘤,但是NSUN3缺陷或突变的肿瘤细胞淋巴结转移以及肺转移能力显著降低。这些数据表明,线粒体tRNAMet在C34位的修饰是肿瘤转移所必需的,但对原发肿瘤的发生和发展来说并不是必需的。

 

那么NSUN3缺陷到底是如何影响到肿瘤转移的呢?已有的结果提示NSUN3缺陷会损伤线粒体有氧呼吸能力,与此一致的是,NSUN3缺陷的肿瘤上调表达葡萄糖转运蛋白GLUT1,考虑到肿瘤组织本就喜欢用糖酵解来供能(Warburg效应),因此NSUN3缺陷不影响原发瘤生长也就不足为奇了。然而,转移中的肿瘤细胞需要有氧呼吸为其提供大量的能量,这有可能是NSUN3缺陷肿瘤转移能力下降的原因。

 

进一步的转录组分析发现,NSUN3缺陷后与线粒体功能相关的基因(如NADP脱氢酶)的表达显著降低;此外,由线粒体DNA编码的呼吸链复合物基因表达水平也显著降低。这些数据提示,线粒体tRNAMet中m5C和f5C修饰缺陷使得肿瘤发生代谢重编程,NSUN3可能依靠线粒体活性驱动肿瘤转移。

 

那么哪些肿瘤细胞更加依赖线粒体功能,有最高的线粒体翻译水平呢?

 

研究团队通过对线粒体标志物——MtCO1和MtCO2——进行染色,发现这两个标志物在基底层CD44+细胞中高表达,而这些CD44+肿瘤细胞正是低分化、具有较强增殖能力的“转移前导细胞”。这些数据表明起始肿瘤转移的前导细胞更依赖线粒体的有氧呼吸能力,暗示线粒体tRNAMet中m5C和f5C修饰缺陷很可能会对前导细胞产生明显的影响。

 

为了进一步探究线粒体中tRNAMet中m5C和f5C修饰缺陷对肿瘤细胞增殖与转移能力的影响,研究团队对肿瘤细胞进行了3D培养,发现NSUN3缺陷的肿瘤细胞与WT肿瘤细胞所形成的肿瘤球大小一致,这表明NSUN3缺陷并没有削弱肿瘤细胞的增殖能力。

 

通过检测线粒体膜电位,研究团队发现在肿瘤球外表面存在少量线粒体膜电位较高的细胞(代表这些细胞线粒体有氧呼吸能力较强),而在NSUN3缺陷肿瘤球表面则没有这样的细胞,表明NSUN3缺陷后肿瘤细胞的线粒体功能被削弱,有氧呼吸能力下降。

 

为了检测肿瘤的转移能力,研究团队将肿瘤球转移至含Ⅰ型胶原的基质胶中,比较肿瘤细胞从球体向周围基质侵袭的能力,结果发现NSUN3的缺陷或敲低使肿瘤细胞的侵袭能力显著减弱。这些数据表明,高水平的线粒体tRNAMet中m5C和f5C修饰促进了肿瘤细胞的转移。

 

以上的数据表明,在体外模型以及小鼠肿瘤模型中,线粒体tRNAMet中m5C和f5C修饰水平极大地影响了肿瘤的转移能力,那么在人类头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者中m5C修饰水平与肿瘤转移之间存在什么样的关系呢?

 

为了解决上述问题,研究团队收集了HNSCC患者组织样本,通过免疫组化检测可见,发生了转移的患者其原发瘤中NSUN3的表达水平更高,并且疾病分期更高(偏向晚期)。通过转录组数据分析,他们发现随着NSUN3表达水平的升高,患者出现淋巴结转移的频率逐渐升高。

 

这提示在HNSCC患者中NSUN3的表达可能驱动肿瘤的转移,与此一致的是,免疫组化检测表明,在肿瘤边界附近的肿瘤细胞上调表达NSUN3,而这些细胞正处于肿瘤转移的前锋位置。这些数据表明,在HNSCC患者中NSUN3的表达(即tRNAMet m5C修饰水平)与患者的肿瘤转移密切相关。

 

综合以上数据,我们知道线粒体中tRNAMet中m5C和f5C修饰水平能够显著地影响线粒体中蛋白质合成效率,影响到线粒体有氧呼吸能力,进而影响肿瘤细胞的转移能力。

 

由于线粒体的翻译过程与原核生物存在一定的相似性,因此一些抗生素可以抑制线粒体中的蛋白质合成而不影响细胞质中的蛋白质合成,如利奈唑胺、氯霉素、替加环素或多西环素。那么使用这些抗生素处理肿瘤细胞能实现与NSUN3缺陷一样的抑制肿瘤转移的效果吗?

 

研究团队使用多种抗生素处理肿瘤细胞,发现仅使用利奈唑胺、氯霉素、替加环素或多西环素处理后,肿瘤细胞才会出现有氧呼吸能力下降的现象;类似地,利用3D培养的肿瘤球,他们发现仅使用利奈唑胺、氯霉素、替加环素或多西环素处理的肿瘤球出现侵袭能力下降的现象,而氨苄西林和阿莫西林等以细菌细胞壁为靶点的抗生素并不能影响肿瘤细胞的线粒体功能与转移能力。

 

小鼠实验也表明,使用替加环素或多西环素治疗能够将小鼠口腔鳞状上皮癌的转移率由80%降低至20%,但是使用氨苄西林治疗则没有降低肿瘤转移率的作用。这些数据进一步说明抑制线粒体中的蛋白质合成能够通过抑制线粒体有氧呼吸,削弱肿瘤的转移能力。

 

总而言之,这项研究发现线粒体中tRNAMet的特定修饰——m5C和f5C——能够显著地影响线粒体中蛋白质合成效率,进而影响线粒体的有氧呼吸能力,并将其与肿瘤转移联系在一起,创新性地发现抑制线粒体tRNAMet的m5C和f5C修饰能够有效地抑制肿瘤转移。这提示我们,抑制肿瘤细胞中的NSUN3或许是一种阻止肿瘤转移的有效方法。

 

值得注意的是,本研究还发现使用特定抗生素处理也能够降低肿瘤细胞的转移能力,而且研究中涉及的替加环素、多西环素等抗生素,在临床上也有较多的应用,副作用比较清晰,这也许会加快相关临床研究的推进速度。

参考文献:

1. Vyas S, Zaganjor E, Haigis MC. Mitochondria and Cancer. Cell. 2016;166(3):555-566. doi:10.1016/j.cell.2016.07.002

2. Haag S, Sloan KE, Ranjan N, et al. NSUN3 and ABH1 modify the wobble position of mt-tRNAMet to expand codon recognition in mitochondrial translation. EMBO J. 2016;35(19):2104-2119. doi:10.15252/embj.201694885

3. Kawarada L, Suzuki T, Ohira T, Hirata S, Miyauchi K, Suzuki T. ALKBH1 is an RNA dioxygenase responsible for cytoplasmic and mitochondrial tRNA modifications. Nucleic Acids Res. 2017;45(12):7401-7415. doi:10.1093/nar/gkx354

4. Delaunay S, Pascual G, Feng B, et al. Mitochondrial RNA modifications shape metabolic plasticity in metastasis. Nature. 2022;607(7919):593-603. doi:10.1038/s41586-022-04898-5

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